絲綢之路是古代東西方商貿(mào)往來的主要通道，精美的絲綢通過國際貿(mào)易被出口至歐亞非大陸的多個國家。然而，由于其生物大分子的特性，蠶絲極易受到外界環(huán)境的影響而發(fā)生降解。如何對土樣中含量極低的絲素蛋白進行檢測，成為研究人員面臨的一大挑戰(zhàn)。
針對上述難題，研究團隊通過材料學(xué)、考古學(xué)、電化學(xué)和免疫學(xué)等多學(xué)科交叉，構(gòu)建了基于金納米顆粒與單克隆抗體的電化學(xué)免疫傳感器，對不同來源、不同種屬、不同保存狀態(tài)的古代絲織品文物進行了定性檢測和定量分析。
研究團隊設(shè)計、制備了可對絲蛋白進行特異性識別的單克隆抗體，合成了形貌、尺寸較為均一的金納米顆粒，通過層層自組裝的方法構(gòu)建基于抗體和金納米顆粒的新型電化學(xué)免疫傳感器；在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了實驗參數(shù)，研究該免疫傳感器的靈敏性、特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性；通過電化學(xué)免疫傳感器對絲素蛋白的檢測，測得該方法的最低檢出限為3.8 pg/mL，這是截止目前世界上公開報道的絲素蛋白最高檢測精度；進而建立了基于電化學(xué)免疫傳感器的絲綢文物檢測體系，以期解決古代絲綢的種屬精準識別、溯源和傳播路徑等問題。
絲綢之路包括草原絲綢之路、沙漠絲綢之路和海上絲綢之路。在過去數(shù)十年中，草原絲綢之路和沙漠絲綢之路沿線出土的絲織品文物越來越多；然而，在海上絲綢之路的古代商貿(mào)航線范圍內(nèi)，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)任何絲織品文物實物，這就為研究海上絲綢之路的形成與發(fā)展帶來了巨大挑戰(zhàn)。證明海上絲綢之路存在絲織品，對了解中世紀東西方跨海貿(mào)易模式具有重要意義。2007年，在廣東近海海域，一艘南宋時期的沉船“南海一號”被打撈出水，船艙內(nèi)發(fā)現(xiàn)疑似含有絲綢微痕跡的土壤樣，利用構(gòu)建的金納米顆粒的電化學(xué)免疫傳感器對這些土壤樣進行深層次的分析鑒定研究。
基于金納米顆粒的電化學(xué)免疫傳感器的自組裝過程
采用層層自組裝的方法構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器。首先，沿著8字形將玻碳電極 (φ= 3 mm) 在麂皮上用20 nm氧化鋁懸浮漿打磨10分鐘，然后分別用無水乙醇和去離子水超聲波清洗5分鐘。接著，用循環(huán)伏安法表征電極以確定其表面的潔凈程度，在確保電極表面已被徹底打磨清洗干凈后，可開始自組裝的過程。
首先，在玻碳電極表面滴加4 μL金納米顆粒溶液，置于37℃恒溫烘箱中干燥2小時，烘干后徹底清洗電極三次。隨后，將20 μL的0.25 M 3-巰基丙酸溶液滴加到電極表面，使金納米顆粒與MPA的巰基間形成金硫鍵，恒溫孵育1小時后徹底沖洗。接著滴加20 μL的MES/EDC/NHS (0.1 M/0.05 M/0.03 M) 溶液于電極表面，在37℃恒溫烘箱中孵育1小時，此時巰基丙酸的羧基端被活化。接下來, 10 μL的單克隆抗體HAPK0111 (1.36 mg mL-1) 被滴加到電極表面，并在37°C恒溫烘箱中孵育60分鐘，在此過程中,抗體的氨基與3-巰基丙酸被活化的端羧基結(jié)合，使抗體被共價固定在免疫傳感器的表面。最后，用去離子水徹底洗滌電化學(xué)免疫傳感器3次，將電極浸沒在0.2% 的BSA中 30分鐘，對其表面未吸附的蛋白位點進行封閉，以降低非特異性結(jié)合水平?；诮鸺{米顆粒的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程如圖1所示。
圖1 基于金納米顆粒的電化學(xué)免疫傳感器的自組裝過程示意圖
電化學(xué)免疫傳感器的靈敏性檢測
為評價電化學(xué)免疫傳感器的靈敏性，絲素蛋白溶液分別被梯度稀釋至0.01 ng mL-1，0.1 ng mL-1，1 ng mL-1，10 ng mL-1 和100 ng mL-1。圖2A展示了不同濃度絲素蛋白溶液的DPV響應(yīng)值，隨著樣品濃度的增加，DPV峰值呈現(xiàn)下降的趨勢。此結(jié)果說明，被免疫傳感器表面抗體捕獲的絲素蛋白越來越多，導(dǎo)致鐵離子/亞鐵離子這一對氧化還原探針與金電極表面的電子傳輸效率受到抑制；也證明本實驗構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器可對不同濃度的絲素蛋白溶液做出不同響應(yīng)。此外，DPV峰值與樣品溶液濃度的對數(shù)值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如圖2B所示，回歸方程為y = - 1.991 Log C + 24.712 (R2 = 0.9946) (y為DPV峰值，Log C為絲素蛋白溶液的對數(shù)濃度)，計算可得電化學(xué)免疫傳感器的最低檢出限為3.8 pg mL-1。
為進一步顯示電化學(xué)免疫傳感器的優(yōu)越性，基于同一單克隆抗體的間接ELISA被構(gòu)建并用于檢測絲素蛋白的檢測。如圖3A所示，隨著絲素蛋白溶液的濃度從1 ng mL-1 緩慢增長至1000 ng mL-1，吸光度的值呈現(xiàn)出一個“S”型的增長趨勢。同時，當絲素蛋白溶液的濃度在10-100 ng mL-1這個范圍內(nèi)時，OD值和樣品濃度展現(xiàn)出一個明顯并且良好的線性關(guān)系。如圖3B所示，將該區(qū)域經(jīng)過線性擬合得到的回歸方程是y = 0.0161 x + 0.0471 C (R2 = 0.9926)，同時計算得出間接ELISA的最低檢出限 (S/N = 3) 為11.4 ng mL-1。與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法相比，免疫傳感器展現(xiàn)出更寬的線性檢測范圍 (0.01 ng mL-1 - 100 ng mL-1) 和更低的檢測下限。電化學(xué)免疫傳感器更優(yōu)越的性能可能由于以下原因：金納米顆粒在電極表面的負載使免疫傳感器的電化學(xué)信號得到增強；抗體通過共價固定在電極表面以形成生物敏感層，抗原通過特異性免疫識別被該層捕獲，抗體-抗原的免疫復(fù)合物一旦形成，電極表面性質(zhì)即會發(fā)生改變，DPV法直接監(jiān)測電信號的變化，提高了免疫傳感器的靈敏度。
圖2 電化學(xué)免疫傳感器對絲素蛋白的測試結(jié)果。(A)不同濃度絲素蛋白的DPV曲線；(B) 不同濃度絲素蛋白的校準曲線
圖3 間接ELISA法對絲素蛋白的測試結(jié)果。(A) 不同濃度蠶絲蛋白的標準曲線；(B)不同濃度絲素蛋白的校準曲線
南海一號樣品的電化學(xué)檢測
從南海一號船艙的三個不同樣品坑1#、3#、8# 內(nèi)提取了土樣，并稀釋至1μg mL-1，利用免疫傳感器進行檢測 (圖4A)。根據(jù)DPV響應(yīng)值，3#，8# 樣品顯示陰性結(jié)果，而1# 則被認為包含絲素微痕跡，證明該土樣中絲素蛋白的存在。為確保結(jié)果的準確性，利用免疫傳感器檢測被稀釋至各種濃度的樣品1# (1μg mL-1、0.5μg mL-1、0.1μg mL-1、0.05μg mL-1和0.01μg mL-1)，所得到的結(jié)果均顯示陽性 (圖4B)，DPV響應(yīng)隨樣品濃度的降低呈現(xiàn)下降趨勢。此外,根據(jù)線性回歸方程,計算得到各濃度下樣品1#中絲素蛋白的含量，分別為0.485% (1μg mL-1)、0.415% (0.5μg mL-1)、0.557% (0.1μg mL-1)、0.514% (0.05μg mL-1) 和0.569% (0.01μg mL-1)，變異系數(shù)為12.2%，說明免疫傳感器檢測結(jié)果具有較高的可靠性。綜上所述，電化學(xué)免疫傳感器在古代絲綢樣品的定性和定量分析中都表現(xiàn)出了優(yōu)越的性能。
圖4 免疫傳感器對南海一號提取土壤樣的檢測結(jié)果。(A)對不同樣品坑內(nèi)土壤樣的檢測結(jié)果；(B) 對1#坑內(nèi)土壤樣的定量分析結(jié)果
對海上絲綢之路沿線出土的絲綢微痕跡進行超靈敏檢測，對研究海上絲綢之路的形成與發(fā)展具有重要意義?；趩慰箻?gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器，與傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測手段相比，較大提升了靈敏度與檢測下限，特別是在南海一號出土文物樣的鑒定中，電化學(xué)免疫傳感器表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能，證明海上絲綢之路中絲織品的存在。鑒于此方法的普適性，其在整個考古分析領(lǐng)域均具有巨大潛能，可將該免疫傳感器應(yīng)用于其他種屬文物的超靈敏檢測，以實現(xiàn)微量樣品的精確分析。
相關(guān)論文鏈接：
Jin Li, Hailing Zheng, Yujie He, et al. ACS Sens. 2019, 4, 3203?3209.
https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acssensors.9b01638
第一作者為浙江理工大學(xué)2017級材料工程專業(yè)碩士研究生李津，通訊作者為其導(dǎo)師王秉副教授和周旸研究館員。
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