絲綢是人類社會發(fā)展過程中重要的紡織品材料，擁有巨大的經(jīng)濟價值和文化價值，是古代中華文明的重要載體和象征。近幾十年來，隨著考古人員的不斷探索，越來越多的古代絲織品在中國境內(nèi)及“絲綢之路”沿線被發(fā)現(xiàn)，向后世傳達出不同歷史階段重要的政治、經(jīng)濟、科技和文化信息。但隨之而來的，就是絲織品的老化和保存問題。作為一種天然大分子，蠶絲容易受到溫度、濕度、紫外線、氧氣、土壤酸堿度和微生物等因素的影響，從而發(fā)生不同程度的老化降解，極大的影響其傳世價值和考古學(xué)價值。因此，總結(jié)絲綢的老化降解規(guī)律、掌握絲綢的降解機理，對古代絲綢科學(xué)價值認(rèn)知具有重要意義。
針對這一難題，中國絲綢博物館周旸團隊和浙江理工大學(xué)王秉團隊合作，采用蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，對大量古代絲織品文物樣和人工模擬老化樣進行高靈敏性和特異性的定性分析和定量研究。首先，利用LC-MS/MS技術(shù)對樣品的不同組分進行鑒定，并采用LFQ和iBAQ技術(shù)對不同蛋白質(zhì)的豐度進行定量分析，確定不同組分的降解程度；最后，分別針對絲素蛋白的結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)制備了特異性抗體，采用Western Blot技術(shù)對絲素蛋白不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的降解情況進行了分析和評估，并提出了絲素蛋白老化降解模型。本研究突破掃描電鏡、紅外分析等傳統(tǒng)方法的限制，從分子和蛋白質(zhì)水平研究絲綢的降解過程，從而可以更加地準(zhǔn)確把握絲綢的老化降解特性和機理。
圖1 基于蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)方法的絲綢文物研究示意圖
得到以下結(jié)論：
（1）通過對堿老化樣與文物樣進行LC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)在人工老化樣品中，檢測出的多肽數(shù)目呈規(guī)律性下降趨勢，而文物樣中的多肽數(shù)目與織物的年代沒有一定的聯(lián)系。對不同絲織品文物樣的絲素蛋白中重鏈、輕鏈和P25鏈進程分析，發(fā)現(xiàn)重鏈、輕鏈和P25鏈降解速率不同。且除了絲素蛋白的主要成分外，還在樣品中檢測到絲膠。絲膠是蠶絲蛋白的主要成分之一，附著在絲膠蛋白表面，起著粘連和保護的作用。實驗結(jié)果表明，無論是古代常用的繅絲和練絲工藝，還是現(xiàn)代工業(yè)常用的堿脫膠方法，都無法完全去除絲膠蛋白。但在長久的埋藏或老化過程中，絲膠蛋白可實現(xiàn)完全降解。
（2）采用LFQ定量技術(shù)分析同種蛋白質(zhì)組分在不同樣品中的相對豐度，其結(jié)果顯示重鏈、輕鏈和P25的相對豐度隨著埋藏時間或老化時間的延長大體上呈現(xiàn)下降趨勢，表明所有的組分都發(fā)生破壞和降解。部分樣品間與時間呈負(fù)相關(guān)的變化趨勢，這表明埋藏環(huán)境與降解過程密切相關(guān)，其影響甚至可能會大于埋藏時間。值得注意的是，在老化初期，輕鏈在人工老化樣中的相對含量快速上升，而后再逐漸下降，這說明在堿老化過程初期，輕鏈的降解相對較少。
（3）采用iBAQ定量技術(shù)分析單一樣品中不同蛋白質(zhì)組分的相對含量，樣品中不同組分含量的差異表明，絲織品文物樣中不同組分的降解速率各不相同，再次印證其降解行為和埋藏環(huán)境相關(guān)。相比之下，人工堿老化樣中重鏈、輕鏈和P25的相對豐度具有明顯的時間相關(guān)性，且重鏈的相對含量明顯偏低，表明重鏈的嚴(yán)重降解。
（4）根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測結(jié)果，絲素蛋白中的所有組分均發(fā)生降解，為進一步研究絲素蛋白中結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的降解特征，分別采用針對無定形區(qū)的特異性抗體pAb-1和針對結(jié)晶區(qū)的特異性抗體pAb-2對樣品進行免疫學(xué)檢測，分析其降解過程。結(jié)果顯示所有的文物樣都能成功的與抗體pAb-1和pAb-2結(jié)合，觀察到免疫條帶，說明在不同年代的絲織品中，無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)都有保留。但是，同種抗體對不同樣品的結(jié)合條帶以及同種樣品對兩種抗體的結(jié)合條帶都各不相同。該結(jié)果表明不同文物樣品中無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)都發(fā)生降解，但降解程度不同。
圖2 絲素蛋白的降解模型
首先破壞晶體中的非晶區(qū)域和相對松散的嵌段，導(dǎo)致晶體區(qū)域中緊密的β-折疊片段暴露并劣化。然后，所有區(qū)域一起退化。
因此我們推測了絲素蛋白的降解模型（圖2）來解釋絲織品的降解行為。晶體區(qū)域分布在無序的無定形基體中，并沿纖維軸方向定向分布?？紤]到H鏈中不規(guī)則的氨基酸序列，結(jié)晶區(qū)域由緊密的β-折疊片段和相對疏松的片段組成，這些片段包含較少有序的β-折疊以及其他構(gòu)象。在降解的初始階段，主要破壞了非晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)中相對較松的區(qū)域，并且大分子鏈隨機斷裂。隨著降解的進行，結(jié)晶區(qū)域中緊密的β-片狀暴露并劣化，導(dǎo)致高度有序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^松散的結(jié)構(gòu)，這可能解釋了有些絲織品文物纖維表觀剝離，斷裂和塌陷的現(xiàn)象。最后，緊密的β-折疊片段和相對寬松的片段以及無定形區(qū)域被進一步破壞并降解成小的多肽。
作為一種天然大分子蛋白質(zhì)，絲素蛋白極易受到外界環(huán)境的影響，且絲素蛋白擁有復(fù)雜的多級結(jié)構(gòu)，每層結(jié)構(gòu)的變化都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性或降解。因此，在千百年的保存過程中，降解是既復(fù)雜又無法避免的行為。對于不同方法制備的人工老化樣來說，老化時間越長，絲素蛋白降解越嚴(yán)重，但根據(jù)絲織品文物樣的表面形貌、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)分析結(jié)果可知，絲素蛋白的降解不僅受埋藏時間的影響，還與埋藏環(huán)境密切相關(guān)。
相關(guān)論文鏈接：
Ruru Chen, Mingzhou Hu, Hailing Zheng, et al. Anal. Chem. 2020, 92, 3, 2435–2442
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b03616
浙江理工大學(xué)2017級材料科學(xué)與工程專業(yè)研究生陳茹茹是論文第一作者，周旸研究館員和王秉副教授是論文的通訊作者。
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